番茄细菌性斑点病菌无Du基因研究进展

　　论文关键词 无Du基因； 抗病基因； 植物防御反应； 过敏性坏死反应
　　论文摘要 番茄细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害，Pseudomonas syringae pv.tomato(Pst)为其病原菌，其与番茄的互作系统是研究植物抗感病机理的典型模式系统。Pst存在2种无Du基因：avrPto和avrPtoB，它们编码的蛋白质均能与番茄抗性基因P￡0编码的serThr蛋白Ji酶互作，符合Flor“基因对基因”学说。AvrPto和AvrPtoB在表达Pto的抗性植物中，与Pto互作，表现无Du功能，引发植物防御反应；而在缺失Pto的感病植物中，它们具有Du性，促进细菌的生长。本文综述了番茄细菌性斑点病菌无Du基因avrPto及avrPtoB的结构特点及其功能，这有助于了解病原物与植物的互作机制，对认识植物的感病性、抗病性以及植物防御反应都具有重要意义。

　　番茄是重要的作物，每年因病虫危害，造成其大量减产。番茄细菌性斑点病是危害番茄生产的重要病害之一，为一种世界性病害，主要危害番茄的叶、茎、花、叶柄和果实。自1933年首次报道以来，在全球26个国家均有发现，我国也于1998年发现。据报道，该病可造成5％～75％的产量损失。该病的病原菌是丁香假单胞番茄致病变种Pseudo—monas syringae pv.tomato(Pst)。
　　Pst与番茄的互作系统是研究病原物与植物互作的典型模式系统，该系统的无Du基因(avirulencegene，avr)和抗病基因(resistence gene，R)符合Flor“基因对基因”学说。当病原物中存在无Du基因avrPto或avrPtoB，寄主中存在并表达相应抗病基因Pto时，无Du蛋白就会与抗病蛋白相识别，Ji活植物防御反应系统，引起过敏性坏死反应(hypersensi—tive reaction，HR)，从而抑制细菌的生长。
　　本文综述了番茄细菌性斑点病无Du基因avrPto及avrPtoB的结构特点及其功能，从无Du基因的角度阐述病原物与植物的互作机制，这对认识植物的感病性、抗病性以及植物防御反应都具有重要意义。
　　
　　1 病原菌Pseudomonas syringae pv. tomato
　　
　　Pseudomonas syringae是上重要的植物病原细菌，根据其宿主特异性，该菌可分为50多个致病变种Pst是其中的一个致病变种，该菌菌体短杆状，直或稍弯，单细胞，大小为(0.1～1)μm×(1.5～4)μm，革兰氏阴性，在含蔗糖的培养基上能产生绿色荧光，超过41℃不能生长。该菌株能够侵染番茄和拟南芥。
　　Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000是Pseudomonas syringae pv.tomato的模式种，2003年C.R.Buell等报道了它的全基因组序列，这是丁香假单胞菌属中第一个被完全测序的菌株，此工作的完成为研究Pst的致病机理奠定了基础。Pst存在2个小种：0号小种和1号小种，2个小种的区别在于它们对抗病番茄具有不同的Du力。在抗病番茄上接种Pst的0号小种，植物会产生HR反应；而在抗病番茄上接种1号小种，Pst大量增殖，引起感病反应。如果将O号小种或1号小种接种于不表达Pro的感病番茄植株上，它们都会引起番茄的感病反应。
　　
　　2　无Du基因简介
　　
　　植物机体内存在防御机制，当植物受到病原菌侵袭时，能够检测到病原菌，从而延迟或抑制疾病的发生。植物的防御反应包括两种：一种是基础防御反应，包括细胞壁的加厚，防御相关蛋白的表达等；另一种是依赖于抗性蛋白的HR反应，是指在抗病植物中存在抗病基因(R)，其表达的抗病蛋白(R蛋白)能够识别病原菌Ⅲ型分泌系统(typeⅢse—cretion system，TTSS)的效应因子，与之互作，从而Ji活植物防御反应系统，引起过敏性坏死反应(HR)，过敏性坏死反应的主要表现就是引起侵染位点的局部快速的程序性坏死反应(programed cell death，PCD)，从而抑制侵染位点病原菌的生长和扩展。
　　病原菌必须克服植物防御反应，从中获得营养得以增殖，才能够使植物发病。很多革兰氏阴性菌侵袭植物都需要TTSS，病原菌通过TTSS将效应蛋白注入植物体内，这些蛋白进入寄主细胞后，可以通过修饰或改变寄主的关键蛋白来促使植物发病。目前已鉴定了50多种可以进入寄主细胞的病原菌效应蛋白，这些效应蛋白进入寄主细胞后，修饰或改变寄主的关键蛋白以改变植物的生理状态，抑制植物防御反应，从而提高病原菌的生存适合度，最终导致其大量增殖，致使植物发病。TTSS中编码Ⅲ型泌出通道的hrp(HR and patho—genicity)和hrc(HR and conserved)基因、编码效应蛋白的avr(avirulence)和hop(Hrp—dependent out protein，依赖hrp的泌出蛋白)基因，均决定着植物病原细菌在寄主和非寄主植物上的反应。
　　无Du基因是病原菌的遗传因子，其编码产物能够Ji发病原物与寄主特异性互作。病原物无Du基因与植物抗病基因产物之间相互作用导致产生的基因对基因抗性是植物抗病性的重要形式。无Du基因(avr)被认为是一类两性效应因子(bifunc—tional effector)，在决定病原细菌的无Du性和致病性两方面均起作用：在含互补抗病基因植物中表现无Du效应，而在不含互补抗病基因植物中显示Du性效应。虽然大部分无Du蛋白的功能至今还不清楚，但已探清一些无Du蛋白的氨基酸序列和已知蛋白序列同源，如avrBs3、pthA以及avrb6都具有NLS(nuclear localization signal)序列，将含有放射性标记的基因嵌入到NLS区，能定位到细胞核中。这就表明，定位于细胞核对于发挥无Du基因功能是必要的。
　　Pst存在2种无Du基因：无Du基因avrPto和avrPtoB。这2种无Du基因均已克隆并获得全序列，1992年从Pst的O号小种中克隆到无Du基因avrP-to，2002年又克隆到了无Du基因avrPtoB。avrPto和avrPtoB序列一致性很低，分别编码具有18ku和59ku的蛋白质。关于它们的功能，2005年N.C.Lin等构建了DC3000△avrPto、△avrPtoB以及△avrPto△avrPtoB突变体，分别接种于感病番茄上，发现野生型DC3000引起的症状较单突变体的症状严重，单突变体的症状又较双突变体严重，而菌群数量没有差别。由此可见，avrPto和avrPtoB是Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000上仅有的无Du基因。
　　AvrPto—Pto和AvrPtoB—Pto符合Flor“基因对基因”学说。AvrPto和AvrPtoB通过TTSS进入到植物体中，在缺失Pto的感病番茄中，它们是Du性因子，能够促进细菌的生长；在表达Pto的抗病番茄中，它们作为无Du因子，能够引起宿主的HR反应。Pto存在于抗病番茄中，编码一个丝氨酸一苏氨酸(Ser-Thr)的蛋白Ji酶，它能特异性的识别avrPto或avrPtoB编码的无Du蛋白，Ji活植物防御反应系统，从而引发植物的抗病反应。
　　
　　3 无Du基因avrPto
　　
　　3．1　avrPto基因结构特点
　　无Du基因avrPto存在于Pst O号小种中，于1992年首次分离。无Du基因avrPto编码一个由164个氨基酸组成的18ku亲水性蛋白质，其N末端具有十四烷基结构域和棕榈酸盐结构域，这两个结构域能将蛋白定位并稳定于植物细胞膜上。缺失．N末端十四烷基结构域的AvrPto突变体G2A，不能将AvrPto定位于植物细胞膜上，也不能与Pto互作，从而不能引起基于Pto介导的抗病反应。因此，推测无Du蛋白AvrPto在Pst的细胞质中合成，通过TTSS进入到植物细胞中，在植物细胞膜上与Pto识别、互作、引起植物的抗病反应。AvrP—to和其他无Du蛋白一样，在GenBank和EMBL中没有发现它的同源序列。
　　avrPto启动子上游具有hrp基因簇，该基因簇位于-42至-34区域，能够调节avrPto的表达，缺失突变-34区域能引起avrPto mRNA表达量急剧下降，因此该位点可能是转录因子的识别位点。-37至-31的核苷酸序列TGGAACC，除了存在于avrPto的上游以外，也存在于其他很多无Du基因的上游，例如，avrPph3、avrB、avrC、avrD、avrRpt2以及hrpAB、hrpF、hrpS。但是，还没有直接的试验结果证明该位点是转录因子的结合位点。
　　分析AvrPto—Pto互作的晶体结构，发现AvrPto—Pro的互作依赖于AvrPto的一端的螺旋束和GINP结构域(Gly-Ile-Asn-Pro)，它们分别能够与Pro蛋白Ji酶的P-1环和P+1环结合。
　　
　　3．2　avrPto的无Du功能
　　avrPto在表达Pto的抗病番茄上具有无Du功能，在缺失Pto的感病番茄上具有Du性功能。将Pst1号小种接种于表达Pto的抗病番茄中，引起寄主的HR反应；将avrPto采用农杆菌的方法转化到表达Pto的Nicotiana tabacum和N.benthami—aria的叶片中，能够引起烟草的HR反应。说明AvrPto是一个能够单独起作用无Du因子，番茄Pto基因家族的成员能够直接或间接地识别它，引起抗病反应。
　　1996年Tang等通过酵母双杂交系统分析AvrP—to和Pto是否能直接互作，结果表明，AvrPto能与Pto发生高度特异性互作，而与Pto基因家族的其他成员不能互作。迄今为止，通过纯化的蛋白还不能证明AvrPto和Pto能否在体外互作，因此还不能证明是否有其他宿主蛋白参与互作。后续的研究发现要Ji活植物抗性，除了需要AvrPto和Pto外，还需要富含亮氨酸重复(leucine-rich repeat，LRR)的Prf蛋白、F—box蛋白SGTl以及HSP90。
　　为了研究AvrPto—Pto互作机制，Shan等构建了AvrPto的多个突变体，发现AvrPto的164个氨基酸并不都是与Pto互作所必需的。Lin等构建重组AvrPto蛋白，即第1～9个氨基酸包含十四烷基化结构域和十六酰基化结构域和部分AvrPto蛋白(29～133)组成融合蛋白，通过农杆菌方法转化到表达Pro基因的抗性番茄中，发现仍然能够引起HR反应；去掉N末端的30个氨基酸以及C末端的40个氨基酸也不影响AvrPto与Pto在酵母双杂交系统中的互作，说明AvrPto的N末端和C末端并不是AvrPto—Pto互作所必需的；点突变AvrPto蛋白164个氨基酸中的60个不影响其与Pto的互作。
　　一直以来，人们认为AvrPto与Pro互作Ji活了Pto的Ji酶活性，然而，最近研究AvrPto—Pto复合体的晶体结构发现，AvrPto—Pto互作并没有改变PtoJi酶活性，而是Ji活了Prf的活性。在缺失AvrPto时，PtoJi酶上的β-1与P+1环能够抑制Prf活性，从而抑制其介导的抗性反应；一旦AvrPto与Pto互作，ProJi酶上的β－1和P+1就会和AvrPto上的螺旋束以及GINP结构域(Gly-Ile—Asn-Pro)互作，从而改变了Pto与Prf原有的互作方式，Ji活Prf，引起Prf介导的抗病反应。